1、本品用作叶酸拮抗剂（如甲氨蝶呤、乙胺嘧啶或甲氧苄啶等）的解毒剂。 2、临床常用于预防甲氨蝶呤过量或大剂量治疗后所引起的严重毒性作用。 3、当口服叶酸疗效不佳时，也用于口炎性腹泻、营养不良、妊娠期或婴儿期引起的巨幼细胞性贫血，但对维生素B12缺乏性贫血并不适用。 4、近年应用亚叶酸钙作为结肠、直肠癌的辅助治疗，与氟尿嘧啶联合应用，可延长存活期。

甲氨蝶呤具有广谱抗肿瘤活性，可单独使用或与其它化疗药物联合使用。具体适应症如下： 1、抗肿瘤治疗，单独使用：乳腺癌、妊娠性绒毛膜癌、恶性葡萄胎或葡萄胎。 2、抗肿瘤治疗，联合使用：急性白血病（特别是急性淋巴细胞性白血病）、Burkitts淋巴瘤、晚期淋巴肉瘤（III和IV期，据Peter分期法）和晚期蕈样霉菌病。 3、鞘内注射：治疗脑膜转移癌（只能使用等渗制剂）。 4、大剂量治疗：大剂量甲氨蝶呤单独应用或与其它化疗药物联合应用治疗下列肿瘤：成骨肉瘤、急性白血病、支气管肺癌或头颈部表皮癌。大剂量甲氨蝶呤应用时，必须应用亚叶酸进行解救。亚叶酸是四氢叶酸酯的衍生物，可与甲氨蝶呤竞争进入细胞内。这种“亚叶酸解救”可在大剂量甲氨蝶呤应用时保护正常组织细胞免受损害。 5、银屑病化疗：甲氨蝶呤可用于治疗对常规疗法不敏感的严重、顽固、致残性银屑病。但因使用时有较大危险，应在经过活检和/或皮肤科医生会诊明确诊断后使用。

本品用于心房颤动、心房扑动时控制心室率；围手术期高血压；窦性心动过速。